Ni-TEDAgaroseResin6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联三（羧甲基）乙二胺（TED）为配体， 螯合镍离子（Ni2+）而制备成的一种介质。Ni-TEDAgaroseResin6FF与Ni2+具有5个螯合位点，使得其对于Ni2+具有很强 的约束力，这一特性赋予了本品具有优异的DTT以及EDTA耐受性。本品用于带有His标签的蛋白纯化时拥有稳定性高、 复杂环境中一步纯化蛋白、目标蛋白质吸附量大（但会低于Ni-NTA）、蛋白洗脱条件温和、介质易再生、重复利用率高等 优点。 产品性质 基质高度交联的6%琼脂糖凝胶 粒径45-165µm 载量~10mgHis-taggedprotein（40KD）/mL基质 耐压0.3MPa，3bar 储存缓冲液20%乙醇 PH稳定性3-12（工作）；2-14（CIP) 化学稳定性10mMEDTA，5mMDTT，5mMTCEP，20mMβ-巯基乙醇，1MNaOH，6M 盐酸胍 运输和保存方法 冰袋运输。2-8℃保存。有效期4年。 注意事项 1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2）本产品仅作科研用途！ 使用方法 一、纯化流程 1缓冲液的准备 缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22µm或0.45µm滤 膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。 2样品准备 2.1细菌或酵母表达的蛋白 1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。 2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysisbuffer）和 PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第2页共3页合。 3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。 4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/mLRNaseA和5µg/mLDNaseI），混匀，置于冰上超声破 碎细胞，至菌液基本保持澄清。 5）收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。 2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白 1）将细胞培养液转移至离心瓶，7000rpm离心15min，收集上清。 2）如样品中含有可耐受范围内试剂，可直接上样； 2.3包涵体蛋白纯化（变性条件） 1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。 2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。 3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。 4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。 5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。 3装柱 1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。 2）将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。 3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进 样管中产生气泡。 4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速， 这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的最 大流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子 水。标上柱床高度。【注】在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%。 5）关闭泵，关闭层析柱出口。 6）如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。 7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。 8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。 4样品纯化 装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明： 1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。 2）3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。 3）至少5倍柱体积的LysisBuffer平衡色谱柱。1mL规格预装柱推荐流速为1mL/min，5mL预装柱推荐流速为5mL/min。 4）利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】若样品粘度增加，即使上样体积很少也 会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。 5）WashBuffer平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。 【注】在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。 6）ElutionBuffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例 如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。 7）建议用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的LysisBuffer和5倍柱体 积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。 5SDS-PAGE检测 将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。 二、在位清洗 当填料使用过程中发现反压过高或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。建议按YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第3页共3页照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。 1去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类 使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也 可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接 触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。 2去除离子作用结合的蛋白 使用1.5MNaCl溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。 附表1可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方 附表2包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方 缓冲液名称配方配制1L溶液所需各种试剂量 LysisBuffer，pH8.08MUrea 20mMNaH2PO4 500mMNaCl NaOH调pH至8.0，0.22µm或0.45µm过滤除菌Urea480.5g NaH2PO4·2H2O3.12g NaCl29.23g WashBuffer，pH6.38MUrea 20mMNaH2PO4 500mMNaCl 0-5mMimidazole NaOH调pH至8.0，0.22µm或0.45µm过滤除菌Urea480.5g NaH2PO4·2H2O3.12g NaCl29.23g Imidazole0.34g ElutionBuffer，pH4.58MUrea 20mMNaH2PO4 500mMNaCl 250mMimidazole NaOH调pH至8.0，0.22µm或0.45µm过滤除菌Urea480.5g NaH2PO4·2H2O3.12g NaCl29.23g Imidazole17.0g缓冲液名称配方配制1L溶液所需各种试剂量 LysisBuffer，pH8.020mMNaH2PO4 500mMNaCl NaOH调pH至8.0，0.22µm或0.45µm过滤除菌NaH2PO4·2H2O3.12g NaCl29.23g WashBuffer，pH8.020mMNaH2PO4 500mMNaCl 0-5mMimidazole NaOH调pH至8.0，0.22µm或0.45µm过滤除菌NaH2PO4·2H2O3.12g NaCl29.23g Imidazole0.34g ElutionBuffer，pH8.020mMNaH2PO4 500mMNaCl 250mMimidazole NaOH调pH至8.0，0.22µm或0.45µm过滤除菌NaH2PO4·2H2O3.12g NaCl29.23g Imidazole17.0g

冰袋运输。2-8℃保存。有效期4年。