Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina 是针对Illumina®高通量测序平台研发的用于CUT&Tag实验的文库构建试剂盒，适用于100-100,000个细胞起始量的样本建库。CUT&Tag是研究蛋白与DNA互作的技术，相较于传统的ChIP-seq、CUT&RUN，该技术具有文库构建时长更短（仅需7小时）、操作更简单、对起始样本要求更低、抗体投入量更少、文库产量更高等优点。经过细胞捕获、一抗孵育、二抗孵育、转座酶孵育、转座酶激活、掺入DNA标准品、细胞裂解、磁珠回收gDNA、文库扩增和磁珠分选等步骤，靶蛋白结合的DNA片段最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。
本试剂盒包含两个独立模块：BOX-I和BOX-II。BOX-I包含结合细胞的ConA Beads、提取DNA 的DNA Extract Beads以及文库纯化的DNA Selection Beads，BOX-II包含细胞透化剂、抗体结合buffer、转座酶结合buffer、蛋白酶K以及后续文库扩增所需的所有试剂。此外，本试剂盒已在不同种类细胞（如293T、K562、CHO、ESC细胞等）中进行了验证，均具有良好的建库效率和建库产量。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库的稳定性和重复性。
- 实验操作简单、实验周期短：建库一步法，节省建库时间；ConA使用，无需离心转管；无需超声片段化；样本投入量低。
- 实验重复性好
产品应用：蛋白质-DNA互作研究：组蛋白修饰调控、转录因子调控等表观作用机制研究。
一、组蛋白修饰H3K27me3和H3K4me3 的DNA结合图谱建库
分别使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb（Cell Signaling Technology Cat#9733）、Histone H3K4me3 antibody (pAb)（Active Motif Cat# B_2615077）和Normal Rabbit IgG（Cell Signaling Technology Cat#2729）作为一抗、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961），使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®对100-1,000,000个293T细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，再使用0.6×和0.4×磁珠分选，文库大小结果使用Qsep和2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
图 Qsep和琼脂糖凝胶电泳进行文库质量分析
二、不同细胞投入量的H3K27me3的 DNA结合图谱建库测序
使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb作为一抗（Cell Signaling Technology Cat#9733）、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961），使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®对100-1,000,000个293T细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K27me3 ChIP-seq数据进行比较。
图 Qsep对不同细胞投入量文库质量分析
图 利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K27me3在染色质上的信号分布和相关性
BOX-I：2-8℃保存，BOX-II：-25~-15℃保存。
Q：冻存组织和新鲜组织推荐哪个?
A：CUT&Tag推荐新鲜组织并制备细胞悬液，如果是冻存组织则需要制备细胞核，同时需要确保细胞核的完整性。植物细胞核提取方法可咨询翌圣生物，我们有完整的植物细胞核提取方案。
Q：已知的转录因子，做CUT&tag实验，是否可以不测序，直接qPCR检测目的基因呢？
A：可以，但qPCR必须在文库扩增之后做，我们的spike-in可以作为内参进行相对定量。
Q：spike in mix 具体的作用是怎样的呢 ？
A：spike in主要用于对给实验数据定量提供依据，类似于内参的作用。对于不知道靶位点的目标蛋白或者处理条件会造成细胞内目标蛋白与DNA结合能力大幅度改变的情况，spike in能够帮助做出更准确的定量，反映这些情况造成的实验假阴性现象。此外，我们的spike in可以用于对目标DNA片段进行绝对定量，保证文章数据的准确性。
Q：做cut&tag总是duplicate多该怎么优化呢？
A：可以适当提高细胞投入量和降低PCR循环数。
Q：IgG对照可以不用做吗？
A：建议做的时候带一个IgG作为阴性对照来评判结合特异性。
Q：在实验过程中，观测到磁珠有凝聚现象怎么办？
A：过长的孵育时间尤其是4℃过夜的情况下，可能会出现部分磁珠凝聚的现象，一般情况下只要大部分磁珠仍处于溶液浸润范围内，则仍然能够得到正常的实验结果，继续进行后续实验即可。如果较大磁珠干结可能会加剧磁珠的凝聚。
Q：对于DNA扩增和建库相关的试剂，如引物和扩增酶，能否使用其他来源的同类试剂？
A：不建议使用本试剂以外的试剂混搭进行实验。整个说明书的实验流程，包括PCR程序都是针对试剂盒内部所 提供的试剂进行优化的，引入任何非本试剂盒的试剂都可能会造成实验的失败。
Q：CUT&Tag目标片段富集的不够好是什么原因？如何改进？
A：二抗、转座体（加镁离子之前）洗涤不够充分；抗体特异性不好、抗体浓度太高等，建议确定所选抗体是否合适、增加抗体稀释度、增加洗涤次数来改善。
Q：阳性对照结果很好，但是目标抗体没有好的富集？
A：（1）抗体问题，请选择可靠的ChIP抗体，尽量避免选择多肽免疫的抗体做CUT&Tag实验。
（2）不同转录因子与DNA结合强度不同，研究对象会通过与其他蛋白形成复合物结合在特定的DNA片段上，必要时可以使用甲醛交联。弱结合的转录因子容易从目标DNA上脱落，另外PolII等转录因子结合的目标片段往往远少于组蛋白，因此打断后的DNA量较少回收效率低，建议适当增加细胞量。
Q：文库条带弥散，没有核小体峰，片段分布范围广？
A: (1)细胞或细胞核完整太低，细胞膜或核膜破裂等，核酸提前释放，导致非特异性酶切，建议细胞或细胞核提取时台盼蓝染色镜检细胞活性和细胞核完整性；（2）PCR扩增条件不合适，循环数太高，导致有大片段的非特异性扩增，和条带弥散。（3）富集问题，需要排除是否是抗体、磁珠富集等步骤是否存在操作问题等。
[1]Sun S, Jiang Y, Zhang Q, et al. Znhit1 controls meiotic initiation in male germ cells by coordinating with Stra8 to activate meiotic gene expression. Dev Cell. 2022;57(7):901-913.e4. doi:10.1016/j.devcel.2022.03.006(IF:13.417)
[2]Yan QY, Lv JL, Shen XY, et al. Patchouli alcohol as a selective estrogen receptor β agonist ameliorates AD-like pathology of APP/PS1 model mice. Acta Pharmacol Sin. 2022;43(9):2226-2241. doi:10.1038/s41401-021-00857-4(IF:7.169)
[3]Liang T, Bai J, Zhou W, et al. HMCES modulates the transcriptional regulation of nodal/activin and BMP signaling in mESCs. Cell Rep. 2022;40(2):111038. doi:10.1016/j.celrep.2022.111038(IF:9.995)
[4]Jiang H, Bian W, Sui Y, et al. FBXO42 facilitates Notch signaling activation and global chromatin relaxation by promoting K63-linked polyubiquitination of RBPJ. Sci Adv. 2022;8(38):eabq4831. doi:10.1126/sciadv.abq4831(IF:14.957)
[5]Kong X, Yan K, Deng P, et al. LncRNA-Smad7 mediates cross-talk between Nodal/TGF-β and BMP signaling to regulate cell fate determination of pluripotent and multipotent cells. Nucleic Acids Res. 2022;50(18):10526-10543. doi:10.1093/nar/gkac780(IF:19.160)
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