翌圣生物MycAwayTM支原体qPCR检测试剂盒（探针法）是基于NAT (nucleic acid amplification techniques)的一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗用细胞中潜在支原体污染的产品。该试剂盒基于荧光探针qPCR原理，采用FAM和VIC这2种荧光探针，分别检测目标序列和内参，可覆盖169种支原体DNA序列。
MycAwayTM支原体qPCR检测试剂盒（探针法）已根据EP 2.6.7等对其专属性、检测限和耐用性进行了全面验证，同时覆盖USP、JP、WHO、ChP等中要求验证的支原体菌株类型，试剂盒性能符合中外法规要求，助力生物医药客户的药物研发项目临床实验申请顺利获得国内外药监局受理。
产品资质
IND获批案例：该试剂盒已有5+项目获CDE&FDA IND申报批准
符合法规：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63药典要求验证，符合国际权威机构的标准。
配合审计：产品生产符合ISO13485质量体系标准，有完善的审计文件
保障品质：试剂盒所需酶原料全自产，且已产业化，供货稳定
技术经验积累：TaqMan法有技术沉淀，Kit灵敏度可达10CFU/mL及以下
专注产品性能：Taq酶抗体库，双封闭抗体提高了Kit特异性、灵敏度、稳定性
操作简便：样本制备和检测总时长<3h，无需培养法的28天等待；
灵敏度高：检测限达到可以替代直接培养法的10CFU/mL；
专属性强：验证了多个亲缘关系物种、常用细胞系和样本基质等，均无交叉反应；
安全性高：试剂盒内阳性对照(PC)无感染性，完全消除污染风险；
防干扰强：引入内部质控(IC)，可排除样本干扰、反应配制异常等因素，有效避免假阴性。
1. 检测限（灵敏度）
根据标准菌株使用说明书以及提取和检测试剂盒说明书，对10 CFU/mL支原体标准菌株进行核酸提取以及检测。每次实验同时进行NCS、NTC样品检测，在NCS、NTC结果合格的同时，每种菌株的24个重复孔的10 CFU/mL样品的检测结果满足24次检测有≥23个检测结果为阳性的要求。
表1. 验证菌株信息
| 编号 | 支原体名称 | 菌液浓度 |
| 1 | Mycoplasma arginini精氨酸支原体 | 10 CFU/mL |
| 2 | Mycoplasma orale口腔支原体 | 10 CFU/mL |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum鸡败血支原体 | 10 CFU/mL |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae肺炎支原体 | 10 CFU/mL |
| 5 | Mycoplasma synoviae关节液支原体 | 10 CFU/mL |
| 6 | Mycoplasma fermentans发酵支原体 | 10 CFU/mL |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis猪鼻支原体 | 10 CFU/mL |
| 8 | Acholeplasma laidlawii莱氏无胆甾原体 | 10 CFU/mL |
| 9 | Spiroplasma citri柠檬螺原体 | 10 CFU/mL |
| 10 | Mycoplasma salivarium唾液支原体 | 10 CFU/mL |
表2. 检测限结果
| 10 CFU/mL | 实验1 | 实验2 | 实验3 |
| 检出率 | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| 总 | 24/24 | ||
选取中外法规药典共提到的10种菌株中的一种精氨酸支原体，进行数据展示。Mycoplasma arginini精氨酸支原体10CFU/mL浓度样品，分三次检测，每次8重复，总检测结果满足24次中≥23个检测结果为阳性。下述展示了三次中的一次实验数据：
表3. 精氨酸支原体的检测结果
| 样品 | FAM Ct | VIC Ct | 结果判读 |
| Mycoplasma arginini 10 CFU/mL | 34.33 | 26.61 | 阳性 |
| 34.22 | 26.58 | 阳性 | |
| 34.05 | 26.57 | 阳性 | |
| 33.90 | 26.51 | 阳性 | |
| 34.41 | 26.91 | 阳性 | |
| 34.11 | 26.83 | 阳性 | |
| 34.43 | 26.95 | 阳性 | |
| 34.04 | 26.80 | 阳性 | |
| NCS | / | 26.48 | 合格 |
| NCS | / | 26.45 | 合格 |
| NTC | / | 26.57 | 合格 |
| NTC | / | 26.72 | 合格 |
| 支原体通道 | IC通道 | ||
 |  | ||
2. 专属性
交叉反应：选取了16 种非柔膜菌纲的菌株、12 种工程细胞和 2 种哺乳动物细胞，进行样本的基因组DNA提取和采用本支原体qPCR试剂盒检测。检测结果得出：支原体目的通道均无起峰，内参IC正常扩增。
表4. 30种菌株和细胞的支原体检测结果
| 编号 | 样品名称 | 结果 | 编号 | 样品名称 | 结果 |
| 1 | 表皮葡萄球菌 | 阴性 | 16 | 丙酮丁醇梭菌 | 阴性 |
| 2 | 鲍曼不动杆菌 | 阴性 | 17 | HEK293 DNA | 阴性 |
| 3 | 嗜酸乳杆菌 | 阴性 | 18 | Vero DNA | 阴性 |
| 4 | 产气肠杆菌 | 阴性 | 19 | CHO DNA | 阴性 |
| 5 | 藤黄微球菌 | 阴性 | 20 | E.coli DNA | 阴性 |
| 6 | 变异链球菌 | 阴性 | 21 | 293T DNA | 阴性 |
| 7 | 铜绿假单胞菌 | 阴性 | 22 | MDCK DNA | 阴性 |
| 8 | 肺炎链球菌 | 阴性 | 23 | SF9 DNA | 阴性 |
| 9 | 白色假丝酵母 | 阴性 | 24 | Hi5 DNA | 阴性 |
| 10 | 肠沙门氏菌肠炎亚种 | 阴性 | 25 | NSO DNA | 阴性 |
| 11 | 枯草芽孢杆菌 | 阴性 | 26 | 毕赤酵母 DNA | 阴性 |
| 12 | 蜡状芽孢杆菌 | 阴性 | 27 | 酿酒酵母 DNA | 阴性 |
| 13 | 腐生葡萄球菌 | 阴性 | 28 | 汉逊酵母 DNA | 阴性 |
| 14 | 空肠弯曲菌 | 阴性 | 29 | 猪DNA | 阴性 |
| 15 | 产气荚膜梭菌 | 阴性 | 30 | 鼠DNA | 阴性 |
图1. 30种菌株和细胞的支原体检测扩增曲线图
3. 支原体qPCR试剂盒产品性能验证总结
表5. 支原体qPCR检测试剂盒性能验证内容和结论
| 性能 | 验证参数 | 试剂盒验证结果 |
| 检测限 | 支原体菌株检测限 | 10种法规药典要求的支原体10CFU/mL，分别检测24次，检出率≥95% |
| 专属性 | 样本基质干扰 | 共测试9种样本基质干扰（其中包括哺乳动物细胞培养基等） |
| 交叉反应 | 与21种常见的工程菌、工程细胞以及哺乳动物细胞基因组DNA无交叉反应 | |
| 耐用性 | 冻融稳定性 | 可经受反复5次冻融，试剂盒性能不受影响 |
| 热加速稳定性 | 37℃条件下10天何4℃条件下30天，试剂盒性能不受影响 | |
| 仪器适用性 | 适用ABI7500、ABI QuantStudio™5、Bio-Rad CFX96 | |
| 覆盖度 | 覆盖支原体DNA种类 | 通过支原体16SrRNA序列进行数据库比对，覆盖包括支原体、螺原体和无胆甾原体在内的169种DNA序列 |
-25~-15℃保存，有效期15个月。
*收到货后，请检查各组分是否齐全，如不立即开封各组分做实验，需立即放入-25~-15℃中保存。注意40618-B需要避光保存。
Q：翌圣3种支原体检测产品怎么选择？
A：40601是PCR法，40612是LAMP法，40618是qPCR法。
40612最快1个小时左右出结果，通过颜色变化判断支原体是否污染，覆盖药典要求的6种支原体(药典要求10种），可用于没有qPCR仪的客户使用
40601是通过巢式PCR后跑胶看条带大小判断支原体是否污染，覆盖药典要求的6种支原体(药典要求10种），可用于没有qPCR仪的客户使用
40618是基于Taqman探针的qPCR方法，覆盖药典要求的10种支原体(药典要求10种），根据欧洲日本药典要求进行了试剂盒性能验证，有完整的试剂盒性能报告。所以如果用于放行检测，推荐使用40618试剂盒
这3款试剂盒都是定性检测试剂盒，目前市面上还没有定量试剂盒出来。
Q：试剂盒中的内部质控对照（IC）是什么？为啥pcr的时候需要稀释？
A：IC采用的是外源性内标，不是内参基因，主要用于监控提取和检测过程。他有两个用处，一是作为提取的一个内部质控，一个是作为pcr的内部质控，提取加入进去因为会损失一部分所以浓度需要高些，但是pcr的话浓度过高会竞争性的去目的核酸，ct值会变小。所以是需要稀释的。
Q：我可以不经过提取，直接使用培养基做检测吗？
A：可以不经过提取直接使用培养基来做，但是我们还是建议使用提取过程，因为有些样本里面抑制物会影响扩增结果。
Q：你们的支原体检测试剂盒能检测出拷贝数吗？你们检测下限是多少？
A：我们支原体检测试剂盒是一个定性实验，不能检测出拷贝数，也没有必要检测出拷贝数。我们的检测下限是最低定量限可做到0.5CFU/mL，对应Ct也小于40。
Q：10CFU/ml=10copies/ul是什么意思呢？
A：我们用10CFU/ml的标准菌株，和10copies/ul的试剂盒里的PC进行PCR对标，Ct值是一致的。
1．支原体检查法<3301>.《中国药典》三部[S]. 北京：中国科学技术出版社，2020：542-543.
2．分析方法验证指导原则<9101>.《中国药典》三部[S]. 北京：中国科学技术出版社，2020：682.
3．药品微生物检验替代方法验证指导原则<9201>.《中国药典》三部[S]. 北京：中国科学技术出版社，2020：684.
4．Mycoplasmas. European Pharmacopoeia[S]. 10th Edition, 2020: Section 2.6.7, 194-199.
5．Mycoplasma Testing for Cell Substrates used for the Production of Biotechnological/Biological Products <G3-14-170>. The Japanese Pharmacopoeia[S]. 18th Edition, 2021: 2678-2682.
6．Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham, et al. Impacts on product quality attributes of monoclonal antibodies produced in CHO cell bioreactor cultures during intentional mycoplasma contamination events. Biotechnology and Bioengineering. 2020;117(9): 2802-2815.
7．Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 2011 Apr-Jun;25(2-3):69-77.
8．A.L. Ingebritson, C.P. Gibbs, C. Tong, G.B. Srinivas. A PCR detection method for testing Mycoplasma contamination of veterinary vaccines and biological products. Lett in Applied Microbiology. 2015 Feb;60(2):174-180.
9． Zhao F, Wang X, Li Y, Chen X, Geng Z, Zhang C. Effects of Dietary Supplementation with Epigallocatechin Gallate on Meat Quality and Muscle Antioxidant Capacity of Broilers Subjected to Acute Heat Stress. Animals (Basel). 2021;11(11):3296. Published 2021 Nov 18. doi:10.3390/ani11113296(IF:2.752).
