T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimizes the transcription reaction system. The kit can synthesize the single-stranded RNA efficiently by uses T7 RNA polymerase, the linear double-stranded DNA with the T7 promoter sequence as the template, NTPs as the substrate to control the DNA sequence downstream of the promoter. During transcription, modified nucleotides can be added to the substrate to prepare biotin or dye-labeled RNA.
This kit can synthesize long transcripts and short transcripts, RNA can be produced 100-200 μg with 1 μg of DNA template input. The RNA synthesized by transcription can be used for various downstream applications, such as RNA structure and function research, RNase protection, probe hybridization, RNAi, microinjection and in vitro translation.
l High yield: can produce up to 200 μg in 2 hours through transcription reaction
l Better versatility: suitable for transcription of 20nt-10000nt RNA
l Excellent performance: effectively reduce the byproducts of transcription during IVT process
l Multiple applications: can be used for ordinary, labeled, and modified RNA synthesis
1、
Figure 1: Yield of transcripts of different lengths
Figure 2: Quality of transcripts of different lengths
Figure 4: Expression of transcribed mRNA in HEK-293 cells
Note:The mRNA has been capped with Vaccinia Capping Enzyme(Yeasen#10614/10615).
Store at -20℃, valid for two years.
Q：Control DNA Template 的长度是多少？
A：大小是1142bp。
Q：T7 试剂盒有帽子结构和polyA 吗?
A：polyA 尾是设计模板时引入，加帽是单独加。
Q: IVT体系如何优化？
A: ①提高NTP，帽类似物的投入量比例；②添加剂的合理应用；③反应温度可以用到40度。
IVT体系优化可以从模板，T7酶的使用量，如果是共转录加帽可以考虑帽子与NTP之间的比例；酶法加帽的话，在加帽酶，2-O-甲基转移酶以及SAM的用量配比上进行条件优化。关于模板除了线性化要完全这一块，还有一点就是序列设计这一块，例如在5’UTR区注意uAUG以及Kozak序列；CDS需要考虑密码子偏好性，GC3含量，双核苷酸偏好性等；3’UTR：RBP以及miRNA结合位点：还有一个就是RNA的二级结构，5’UTR前序列稳定的二级结构会降低mRNA的表达；3’UTR稳定的二级结构会提高mRNA稳定性，促进mRNA编码蛋白的表达。推荐的IVT体系和更多细节tips，请参考翌圣生物mRNA体外合成实验手册。
Q: IVT反应20ul体系放大到10ml,产量下降，单位体积产物得率下降约50%；你们是否遇到过这种情况，有何建议？
A: 20uL体系等比放大到10mL应该得率差不多的，我们一般从20uL直接放大到50mL，得率基本也在100ug/20uL的水平；我们50mL也会用离心管和金属浴的方式来测，10mL正常来说应该放大效果更好；这种情况下，一般建议酶和NTP的终浓度微调一下再试试。
Q: 现在大多数mRNA完整性能做到多少？
A: 就我们的其他客户返样，我们用Qsep100测的CE结果来看，比较理想的状况CE完整度能到88~92％；当然做到这个水平通常也需要经过一系列的优化；
一般产量是在120-220ug/ul（产量与序列设计有很大关系），共转录方式，mRNA产量有8g/L，做工艺优化产量会提升，目前市面上的工艺质量参数，有的是观察GFP的荧光值，有的是用lc-MS测量加帽率。
Q: 你们自己测试过程中是否会用琼脂糖电泳来检测mRNA产物？
A：RNA电泳我们也会做，主要是简要的看一下产物纯度，是否有明显的聚体这些；如果是看RNA大小，电泳的时候一般会点一个明确大小的RNA样，作为参考。
Q: 你们会对DNA模板中的Rnase残留进行检测吗？
A: 对模板的检测目前能找到的主要是序列完整性还有内毒素、宿主核酸残留这些检项，RNase还没有明确找到对应的检测建议方法；或者也可以参考我们酶产品中RNase残留的检测方法，相对还是比较简单可靠的。
Q: IVT反应过程中dsRNA的生成机制是什么？
A：IVT过程中的ds生成有多种可能的原因，主要有：
①T7 pol会以产物RNA作为模板，在其3'末端继续延伸RNA，延长序列与原RNA分子3'末端序列互补配对，形成发卡结构；
②T7 pol可以把RNA当作模板来复制RNA分子，合成与其互补的另外一条链；
（除去dsRNA目前是没有很好的方式，有专利报导用纤维柱（sigma）可以试一试）
Q: 控制体外转录阶段产物中dsRNA含量是否有可行的方案？
A：关于优化IVT体系与反应条件抑制dsRNA的建议主要还是以下几点：
①降低镁离子浓度；但降低镁离子浓度也会导致RNA合成产量的降低，需要去一个平衡点；
②提高IVT反应温度，50-56℃的反应温度能有效降低产物中dsRNA的含量；但是高温反应对工艺放大设备的要求会不一样，也可能提高成本；
③IVT反应体系中添加某些离散剂，如尿素、甲酰胺等；这个路线我们的工艺研发团队也做了一些摸索，是可以起到抑制dsRNA的效果的，但是否适合工艺放大还有待进一步研究
Q: IVT的反应过程中出现沉淀的原因是什么，怎么优化？
A: 内部有研究过这个沉淀，是镁离子、RNA、钠离子和焦磷酸镁的聚合物，且有个凝聚作用，聚团会不断变大（类似的胶状、絮状、颗粒沉淀都是类似原理）， 加水和加EDTA的效果类似也佐证了这个说法。原因：1.Mg离子浓度过高会和焦磷酸聚集形成焦磷酸镁沉淀，但是具有聚合作用，不断地包裹核酸形成胶状物导致产量下降。2.RNA产量较高也会析出沉淀。
这种沉淀的产生是偶然性的，与序列设计也有很大关系。
解决办法：（1）减少镁离子的浓度，但会牺牲产量，需要增加T7酶用量以及延长反应时间（从2h，延长到3-4h）;（2）NTP的存在形式（镁离子浓度高，例如46mM是不会挑NTP的，但当镁离子浓度降低，NTP（Tris盐形式）产量无太大变化，三Na形式的NTP产量下降明显。
Q: mRNA生产阶段工艺放大的反应器选择有什么思路？
A：可以考虑WAVE、海道夫反应釜、赛多利斯，主要还是需要找到和现有IVT体系适配的袋子；对于搅拌罐体，螺旋桨的转速也需要根据实际情况优化，跟桨叶类型和大小有关系，建议可以向设备生产厂家咨询。
Q: 你们推荐两步法的还是一步法的？为啥目前很多都还是使用的两步法的？
A: 工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA，Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶（2'O-methyltransferase）的作用下进一步修饰成Cap 1（m7GpppmN）。利用酶法加帽，加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便，但由于GTP会竞争帽状二聚体，因此该方法加帽率低一些；两种方式各有优缺点。
Q: IVT体外转录产量有多少？
A: 目前我司体系为20ul的反应体系，体外转录的产量为100-200ug，内部的放大体系10ml可达到50mg—100mg。
Q: 体外转录随着反应时间的延长大于2h之后，完整度和产量比较会降低？生成的mRNA如何保证稳定性？
A: 建议整个反应时间在2-3小时之间，我司验证最长3h反应，合作客户有验证4h 反应结果正常。
Q: 是否可以帮忙设计mRNA体外转录DNA模板序列（主要是新冠疫苗应用方向的）？
A: 不提供相关服务。新冠疫苗目前主要可以直接参考的还是外网开源的BioNtech和Moderna的疫苗序列。主要原件序列基本是可靠的，除了polyA尾不全；国内比较早的新冠疫苗，还是基于RBD蛋白序列的比较多。这块我们没有要到具体的序列，基本都是各个研发团队的核心技术了。
Q: 翌圣加帽率、加尾检测用的什么方法，什么仪器？
A: 加帽用的是安捷伦系列（6230B TOF），加尾用的Thermo的QE或waters的Rda。
Q: 你们加A尾的方式是采用加尾酶的吗？你们一般建议连接多少个碱基？
A: 我们这个试剂盒没有加poly A尾的组分，可以在模板制备阶段将A尾构建到质粒上，长度一般在20-200。
Q：产品纯化步骤，以最大速度离心 是多大的转速呢？
A：13000rcf 以上都可以的。
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al. Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) Increases Fungal Pathogenicity by Modulating BmPEX16 Gene Expression in Its Host, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Ultrasensitive quantitation of circulating miR-195-5p with triple strand displacement amplification cascade. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
