Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
- 特异性高：抗体法热启动&Buffer优化，最大程度减少二聚体生成
- 灵敏度高：可有效检测低拷贝数模板
- 高荧光值：荧光信号值更高，曲线线型更好，信噪比更高
- 精密度好：可精准区分2倍模板差异，复孔间差距小
- 多平台适用：适用于多种qPCR仪器，无需调整ROX浓度
- 特异性高
图.以人源cDNA为模板，扩增56组不同GC含量的基因片段(部分曲线如上方展示)，结果显示，11185ES的特异性优于其他品牌，数据统计显示11185ES在这些样本中非特异性概率约为5.4%，其他品牌在同种样本中的非特异性概率约为53.6%。
- 灵敏度高
图.分别在不同类型仪器上以101-107拷贝的IL23R质粒为模板，扩增IL23R基因。结果显示在不同浓度模板下，11185ES的灵敏度更加优秀，Ct值更小，同时荧光平台期更高，曲线线型更好，信噪比更高。
- 精准区分2倍模板差异
图.分别以稀释10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍的人源cDNA为模板，扩增人GAPDH基因。测试结果显示11185ES能有效区分2倍模板浓度差异。
*备注：模板浓度差5倍，Ct值则相差2.322，22.322=5
图.分别以人源cDNA原液稀释了20倍、100倍和200倍的cDNA为模板，扩增60%GC含量的基因片段。数据显示11185ES针对不同浓度模板的分辨率优于其他品牌，且荧光值更高，曲线线型更好，信噪比更高。
-25~-15℃避光保存，有效期18个月。
Q：建议qPCR 实验用几步法？
A：常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。
Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？
A：有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（3）熔解曲线：为单一峰。
Ct 值大于 15 个循环是因为 3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。
Q：同一基因复孔间熔解曲线 Tm 值有差异？
A：同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。
Q：为什么稀释了模板CT 值反而变小了？
A：一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。
Q：为什么扩增曲线杂乱且不连续？
A：可能原因是 ROX 添加不当。确认参比染料ROX 是否添加正确。
Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？
A：(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。
(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。
Q: 为什么扩增产物跑胶会有拖尾的现象？
A: 试剂中含有稳定性成分，本身不参与任何反应，但在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。
Q: 试剂比较粘稠，容易产生气泡，如何避免？
A: 可以先混合大体系，再分别加到离心管里面，最后加模板；
枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；
另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。
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