Exosome（外泌体）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；Exosome携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

本试剂盒采用独特的分离技术，可以快速从乳液中获得大量完整的外泌体颗粒，适用于下游的细胞共培养、电镜分析、Western Blot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。

组分信息

* Nuclease-free, Sterile

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使用说明

1. 样本预处理

1) 取样：收集新鲜的样品，置于冰上待用；若为冻存的样品，可于冰箱取出后放于25℃水浴中解冻，待完全融化后置于冰上待用；

2) 样品初始用量：单次提取时的乳液量建议不低于25 mL；

3) 离心去脂：将样品转移至离心管中，于4℃以10,000×g离心20 min，去除样品中的脂质及部分蛋白(注：离心后样品分为三层，上层为脂质层，下层为蛋白沉淀，中间层为乳清。离心后上层状态为“致密、稳定、不易脱落”，若上层“松软、易脱落”且下层沉淀较多，可重复此步骤，每次离心取中间层液体)；

4) 乳清转移：将去除脂质的乳清（中间层液体）转移至新的50 mL离心管中（注：可用枪头将上层脂质戳破后缓慢倾倒，或用移液器转移，转移后的乳清中带有少量脂质和沉淀是正常现象，不影响后续实验）。

2. 去除杂蛋白

1) 乳清澄清：乳清中加入Solution A，将离心管颠倒混匀至呈现“半透明状”，再加入Solution B，颠倒混匀后于2~8 ℃静置10 min；（注：静置完成后轻轻晃动离心管，呈现“豆花状”固体，液体部分为“透明状”。若未呈现“豆花状”或样品仍为“乳白色”，可再适当加入Solution B至液体为“透明状”）

注：具体加入量根据乳清体积按上表等比例换算。

2) 离心去蛋白：将澄清后的乳清于4℃以10,000×g离心10 min，收集上清液；

3) 上清液过滤：将收集的上清液转移至50 mL离心过滤中，于4℃以5200 rpm（注：若未过滤完成，可重复此步骤。50 mL离心过滤柱为一次性耗材，不建议重复使用）；

4) 将过滤后的上清液转移至新离心管中，加入Solution C后颠倒混匀（注：Solution C加入剂量和Solution B剂量保持一致）。

3. 外泌体提取

1) 上清液预处理：在加入Solution C后的上清液中加入Solution D，具体加入剂量如下(其他剂量请根据表中的用量等比例换算):

2) 溶液混合：加入Solution D后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1min，再放置4℃静置1h以上(注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过24h)；

3) 沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10,000×g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒(注：尽可能吸尽上清液)；

4) 再次离心：将含有沉淀的离心管再次于4℃以10,000×g离心2 min，弃上清(注：尽可能吸尽上清液)；

5) 外泌体重悬：取合适量的1×PBS均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中(建议每25 mL乳液用200 μL左右1×PBS重悬)；

5) 收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12,000×g离心2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒(若沉淀较多，可12,000×g, 2 min离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液)；

4. 外泌体纯化

1) 纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入41209-E上室中，于4℃以3,000×g离心10 min，离心后收集柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒(注：离心过滤柱不可重复使用)；

2) 外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

注意事项

1) 如果想要进一步纯化外泌体，可以使用相应抗体包被的磁珠进行亲和纯化。

2) 产品只针对乳液样本，不适用其它血清/血液或者是细胞培养上清中外泌体的抽提；如果需要进行细胞上清外泌体分离，请选用细胞培养上清外泌体快速抽提试剂盒。

3) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4) 本产品仅作科研用途！

室温运输，本试剂盒可于室温稳定保存24个月。