总一氧化氮检测试剂盒（Total Nitric Oxide Assay Kit, 即Nitrate/Nitrite Assay Kit）采用了硝酸盐还原酶(Nitrate reductase)还原硝酸盐(nitrate)为亚硝酸盐(nitrite)，然后通过经典的Griess reagent检测亚硝酸盐，从而测定出总一氧化氮。一氧化氮本身极不稳定，在细胞内很快代谢为硝酸盐和亚硝酸盐，通过上述方法检测出所有的硝酸盐和亚硝酸盐的量，就可以推算出总的一氧化氮的量。
本试剂盒采用的是NADPH依赖性硝酸盐还原酶(NADPH-dependent nitrate reductase)。高浓度的NADPH会干扰后续的检测，因此在Griess Reagent检测之前需要消除过量NADPH对后续试验的干扰。乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)是常用的NADPH消除试剂，通过其清除作用，保证了检测结果的准确性。
本试剂盒具有以下特点：1）检测灵敏度高：对亚硝酸盐的检测下限达到2 μmol/L，在2-80 μmol/L的范围内有很好的线性关系。浓度过高的样品可以适当稀释后再进行检测。2）适用范围广：对于各种样品的检测，包括细胞、组织、细胞或组织的培养液、血清、血浆或尿液等。3）抗干扰能力强：酚红和10%血清对测定无明显干扰。4）样品用量少：仅需0-60 μL样品，取决于样品内一氧化氮的浓度。5）检测周期短：仅需约80 min即可完成检测。
产品组分
| 编号 | 组分 | 产品货号（规格） | 保存方法 | |
| 50107ES50 (50 T) | 50107ES70 (200 T) | |||
| 50107-A | Assay Buffer 反应缓冲液 | 15 mL | 15 mL | -20 ℃ |
| 50107-B | Enzyme Cofactor 反应辅酶 | 5 mg | 5 mg | -20 ℃避光 |
| 50107-C | Enzyme Enhancer反应增强子 | 550 μL | 1.1 mL×2 | -20 ℃ |
| 50107-D | Nitrate Reductase硝酸还原酶 | 250 μL | 1 mL | -20 ℃避光 |
| 50107-E | LDH Buffer LDH 缓冲液 | 550 μL | 1.1 mL ×2 | -20 ℃ |
| 50107-F | LDH乳酸脱氢酶 | 500 μL | 1 mL×2 | -20 ℃ |
| 50107-G | Nitrite Standard亚硝酸盐标品(1 M) | 1 mL | 1 mL | -20 ℃避光 |
| 50107-H | Griess Reagent I Griess 试剂 I | 3 mL | 12 mL | -20 ℃避光 |
| 50107-I | Griess Reagent II Griess 试剂 II | 3 mL | 12 mL | -20 ℃避光 |
注意事项
1）RPMI 1640等含有较高浓度硝酸盐的培养液易对本试剂盒的检测产生干扰，请尽量避免。必须使用RPMI 1640培养液时，在检测一氧化氮前必需先换成其他适当培养液如；DMEM、MEM、F12等，或HBSS或PBS缓冲液等。
2）检测反应必须避光进行。
3）由于检测过程中涉及还原反应，因此影响还原反应的氧化或还原试剂要注意避免，如还原剂DTT和巯基乙醇。
4）本产品仅作科研用途！
检测步骤
1. 样品处理
含有高浓度蛋白的样品如血清、含有高浓度血清的细胞培养液等，在加入Griess Reagent I后可能产生沉淀。可取50 μL样品，加入50 μL Griess Reagent I进行测试，观察是否产生沉淀。如产生沉淀，可把样品沸水浴加热5 min，以变性蛋白，然后12,000 g离心5 min，取上清用于后续的测定。对于细胞或组织样品可以使用无蛋白酶或者磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液进行裂解。对于尿液样品，通常需要用水稀释10-50倍后检测。不宜使用肝素抗凝的血浆，肝素抗凝的血浆在和Griess Reagent反应时会产生沉淀。
2. 稀释标准品
用制备或者稀释样品所使用的溶液把1M亚硝酸盐标品稀释成 2、5、10、20、40、 60、80 μmol/L。例如样品为细胞裂解液，则用该裂解液稀释标准品；样品为细胞培养液，则用该培养液稀释标准品。如果样品为血清，则可以使用本试剂盒提供的反应缓冲液（50107-A)或简单地使用PBS、生理盐水等适当溶液稀释标准品。
3. 试剂的准备
a. 加约1 mL蒸馏水或MilliQ级纯水至5 mg反应辅酶(50107-B)中，颠倒混匀溶解后，再用蒸馏水或 MilliQ级纯水定容至3 mL，配制成2 mM反应辅酶溶液，除立即使用的部分外，其余反应辅酶溶液必须立即分装后-70 ℃冻存。
b. 反应增强子(50107-C)已经配制在适当溶液中。反应增强子可以适当分装后-20 ℃或-70 ℃保存。
c. 硝酸还原酶(50107-D)和LDH (50107-F)在临用前取出，并放置在冰浴上使用（注意在使用完毕后立即-20 ℃保存）。试剂盒中的其余各种试剂在溶解后保存在冰浴上。Griess Reagent I和Griess Reagent II在使用前需达到室温。
4. 参考下表依次加入标准品、样品和检测试剂并进行相应检测：
| 空白对照 | 标准品 | 样品 | |
| 标准品 | — | 60 μL | — |
| 样品 | — | — | x μL |
| 用于样品稀释的溶液 | 60 μL | — | (60-x) μL |
| 反应辅酶（2mM） | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
| 反应增强子 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| 硝酸还原酶 | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
| 混匀后，37 ℃孵育30 min | |||
| LDH 缓冲液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| LDH | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| 混匀后，37℃孵育30 min | |||
| Griess 试剂 I | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
| Griess 试剂 II | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
| 混匀后，室温（20-30 ℃）孵育10 min后测定A540吸光度值 | |||
【注】：a.反应必须避光进行。如果使用96孔板进行检测，可以使用铝箔纸包裹96孔板进行避光。
b.样品的用量上限为60 μL，血清、血浆或组织匀浆液通常使用40 μL。样品不足60 μL时，不同样品之间的体积最好能保持一致，体积不足的部分用用于样品稀释的溶液补足。用于样品稀释的溶液是指实际用于样品稀释的溶液或裂解样品的溶液。标准品可以参考上表直接使用60 μL。
c.可以同时设置加入200 μL水或PBS的2-3个孔为阴性对照，这2-3个孔仅仅加入水或PBS，不再加入任何其他试剂。
d.第一部分37 ℃孵育30 min后，直接参考上表依次加入LDH缓冲液和LDH，并进行后续孵育。
e.第二部分37 ℃孵育30 min，直接参考上表依次加入Griess 试剂I和Griess 试剂 II。加入Griess试剂 I后需要轻轻混匀。
f.每次混匀后，可以1000-3000 g离心数秒，把液体沉淀到管底。同时需避免各检测孔中产生气泡，以免气泡干扰检测结果。
g.检测时，如无540 nm滤光片，520-560 nm的滤光片也可以使用。如无酶标仪或合适的滤光片，也可以通过 数码相机拍照后在适当图形软件中进行定量分析，并 确定样品中一氧化氮的浓度。拍照比色时标准品需要更为精细的浓度梯度。
5. 根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮的浓度。
常见问题
1. 检测结果标准曲线良好，但样品的吸光度很低，和空白对照接近。
标准曲线良好说明检测方法和检测试剂盒基本上没有问题，样品吸光度低说明样品中一氧化氮含量很低。可以采取的办法是：（1）加大样品和标准品的使用量至60 μL，其余试剂用量不变。（2）把整个检测体系每种试剂的用量加大50%，这样可以使检测灵敏度增加约50%。如果上述方法还不能解决问题，可以考虑浓缩样品，即一方面在收集样品的时候尽量使一氧化氮的浓度保持得较高（例如裂解细胞时采用较小体积的裂解液），另一方面可以考虑用真空干燥或真空冷冻干燥的方法浓缩样品。对于培养的细胞，通常上清液测定出来的吸光度相对较低，而细胞裂解液测定出来的吸光度会稍高一些。
2. 检测时发现每个样品的吸光度都非常高。
在使用RPMI 1640培养液时会发生这种情况。因为RPMI 1640培养液中含有高浓度的硝酸盐从而会使样品检测出来的吸光度都非常高。其他含有高浓度硝酸盐的试剂也会产生类似情况，影响氧化还原反应的试剂也可能产生类似干扰。使用过程中避免使用RPMI 1640等可能导致干扰检测的试剂即可。
客户使用本产品发表的科研文献（部分）
[1] Su JC, et al. Structurally diverse steroids from an endophyte of Aspergillus tennesseensis 1022LEF attenuates LPS-induced inflammatory response through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Chem Biol Interact. 2022 Aug 1; 362:109998. doi: 10.1016/j.cbi.2022.109998. Epub 2022 May 29. PMID: 35649461. IF：5.194
冰袋运输。-20 ℃保存，有效期一年。反应辅酶配制成溶液后必须分装并-70 ℃保存。
Q：检测时样品的吸光度很低，和空白对照组差不多，这可能是什么原因？
A：首先确认一下标准曲线线性是否良好，确认没问题的话可以简单排除试剂盒和操作问题。吸光度低说明样品中的一氧化氮含量很低，可以通过增加标准品和样品的使用量至 60 微升， 其余试剂用量保持不变；或者把整个检测体系每种试剂的用量加大 50%，这样可以使检测灵敏度增加 50%。
Q：检测时发现每个样品的吸光值都差不多，值都很高，是检测试剂过量或者样品过量了吗？
A：考虑是否是培养基的影响，使用RPMI 1640 培养液时会发生这种情况，因为 RPMI 1640 培养液中含有高浓度的硝酸盐，会导致测得的吸光度都非常高。
Q：用这个试剂盒可以直接检测细胞上清的NO 含量吗？
A：一般细胞培养液中的NO 水平很低，除非是经典的NO 释放模型。所以我们建议检测细胞裂解液中的NO 水平。如果一定要检测细胞培养液，细胞培养时尽量少用一些细胞培养液，以浓缩NO。
[1] Su JC, Pan Q, Xu X, Wei X, Lei X, Zhang P. Structurally diverse steroids from an endophyte of Aspergillus tennesseensis 1022LEF attenuates LPS-induced inflammatory response through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Chem Biol Interact. 2022;362:109998. doi:10.1016/j.cbi.2022.109998(IF:5.194)
